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RT-PCR試劑盒樣品制備操作步驟

瀏覽次數:39發布日期:2021-07-09
  RT-PCR試劑盒樣品制備:
  本試劑盒是把RNA合成cDNA,然后再對此cDNA進行擴增的試劑盒。RNA的純度會影響cDNA的合成量,而制備RNA的關鍵是要抑制細胞中的RNA分解酶和防止所用器具及試劑中的RNA分解酶的污染。
  因此,在實驗中需要采取以下措施:戴一次性干凈手套;使用RNA操作專用實驗臺;在操作過程中避免講話等等。通過以上辦法可以防止實驗者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。
  【使用器具】
  盡量使用一次性塑料器皿,若用玻璃器皿,應在使用前按下列方法進行處理。
  (1)用0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃下處理12小時。
  (2)然后在120℃下高壓滅菌30分鐘以除去殘留的DEPC。
  RNA實驗用的器具和儀器建議專門使用,不要用于其它實驗。
  【試劑配制】
  用于RNA實驗的試劑,須使用干熱滅菌(180℃,60min.)或用上述方法進行DEPC水處理滅菌后的玻璃容器盛裝(也可使用RNA實驗用的一次性塑料容器),使用的無菌水須用0.1%的DEPC處理后進行高溫高壓滅菌。
  RT-PCR試劑盒實驗用的試劑和無菌水都應專用,避免混用后交叉污染。
  【制備方法】
  使用簡單的RNA純化方法即可獲得滿足于RTPCR反應的RNA(只需少量的RNA便可進行RT-PCR反應)。但為了保證實驗的成功率,建議使用GTC法(異硫氰酸肌法)制備的高純度RNA。
  使用Catrim ox-14MRNA Isolation Kit Ver.2.11(TaKaRa CodeDWA005)可從血液中快速提取高純度的TotalRNA。
  使用本試劑盒進行RT-PCR反應時,每次反應所需的適量TotalRNA約為500ng。
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