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脫氮副球菌探針法熒光定量PCR檢測試劑盒反應流程常規程序

瀏覽次數:137發布日期:2021-05-20

脫氮副球菌探針法熒光定量PCR檢測試劑盒反應流程常規程序:

將PCR反應所需的成分配置完后,在PCR儀上于94-96℃預加熱幾十秒至幾分鐘,使模板DNA充分變性,然后進入擴增循環。在每一個循環中,先于94℃保持30秒鐘使模板變性,然后將溫度降到復性溫度(一般50-60℃之間),一般保持30秒鐘,使引物與模板充分退火;在72℃保持1分鐘(擴增1kb片段),使引物在模板上延伸,合成DNA,完成一個循環。重復這樣的循環25~35次,使擴增的DNA片段大量累積。最后,在72℃保持3-7min,使產物延伸完整,4℃保存。

2.復性(退火)和延伸溫度

復性的溫度是PCR擴增是否順利的關鍵因素,通常在50-60℃之間。具體的溫度主要由引物的Tm值決定。延伸溫度絕大多數設定為72℃。如果復性的溫度很高,可以將延伸溫度和復性溫度設置成同一溫度,變成二步法PCR。

3.PCR反應液的配制

PCR反應體系的配置方式有時也會影響反應的正常進行。常規方法與其它酶學反應一樣,在最后加入DNA聚合酶。早期的PCR儀沒有帶加熱的蓋子,要求在反應液上覆蓋一層礦物油,防止水分蒸發。

對于使用具3’-5’外切活性的高溫DNA聚合酶時,有時會擴增不出產物。在遇到這個問題時,如果將反應成分分開配制,A管含模板、引物和dNTP,以及調整體積的H2O,B管含緩沖液、DNA聚合酶和水,然后再將兩管溶液混合起來,可較好地克服這個問題。

按照常規的方法配制反應體系,有時會出現非特異性擴增的問題。熱啟動(hotstart)PCR操作方式可較好解決這一問題。將dNTP、緩沖液,Mg2+和primer先配制好,然后加入一粒蠟珠(如AmpliWaxPCRQam100),加熱熔化,再冷卻,使蠟將溶液封住,最后加入模板和DNA聚合酶等剩余成分。只有當PCR反應進入高溫階段后,蠟層熔化,所有反應成分才會混合在一起。

4.循環次數

循環次數主要與模板的起始數量有關,在模板拷貝數為104~105數量級時,循環數通常為25~35次。

平臺效應(plateaueffect):PCR擴增過程后期會出現的產物的積累按減弱的指數速率增長的現象。原因:底物和引物的濃度已經降低,dNTP和DNA聚合酶的穩定性或活性降低,產生的焦磷酸會出現末端產物抑制作用,非特異性產物或引物的二聚體出現非特異性競爭作用,擴增產物自身復性,高濃度擴增產物變性不徹底。

5.反應時間

變性步驟一般使用30秒鐘,如果模板的G+C含量較高,或直接用細胞做模板,變性時間可適當延長。復性時間有30秒種一般是足夠的。延伸時間由擴增產物的大小決定,一般采用1kb用1分鐘來保證充足的時間。

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